安理科技：追求技术突破、专注产品创新、获得更好实验结果！

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安理汇||能量代谢实验常见问题集锦

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[原理部分]

Q1. Seahorse测量的是什么？得到的数据有哪些？ 

      Seahorse通过两种荧光染料同时检测细胞外环境中（也就是培养基中）O2的消耗和H+的产生，得到的数据有OCR（耗氧率）、ECAR（细胞外酸化率）和PER（质子流出率）。由于细胞生成ATP的代谢途径有两条，分别 是发生在线粒体的氧化磷酸化和发生在细胞质的糖酵解，氧化磷酸化会消耗O2，而糖酵解会产生H+，因此通过对培养基中O2浓度和H+浓度变化的测量，可以准确反映线粒体氧化磷酸化和糖酵解这两条代谢途径的变化。

     根据OCR和PER，还可以计算出分别来源于氧化磷酸化和糖酵解的ATP产生速率，得到两者的比例，而两者的比例可以表征细胞的代谢表型。什么是代谢表型呢？代谢表型就是，细胞内同时存在氧化磷酸化和糖酵解两条代谢途径，都能够生成ATP，如果细胞利用哪条途径产生更多的ATP，那么细胞就是更偏向于哪一条代谢途径。这就是  ATP速率测定试剂盒的原理。

Q2. Seahorse什么样的数据能大致判断实验结果靠谱不？ 

    通过大量的结果数据，24机型基础OCR值范围50～400(pmol/min)，基础ECAR值范围20～120(mpH/min)；96机型基础OCR值 范围20～160(pmol/min)，基础ECAR值范围10～90(mpH/min)。这个范围内的值，还是比较靠谱的。
Q3. 如何选择试剂盒？
     根据研究问题选择对应的试剂盒类型：
a线粒体功能分析
推荐试剂盒：线粒体压力测试（Mitochondrial Stress Test）用于评估线粒体呼吸链的完整性和功能（如基础呼吸、ATP生成、最大呼吸能力等）。
b糖酵解活性分析
推荐试剂盒：糖酵解压力测试（Glycolysis Stress Test）评估细胞糖酵解能力（如基础糖酵解、最大糖酵解能力、糖酵解储备）。
c细胞能量代谢表型分析
推荐试剂盒：ATP定量检测试剂盒，同时检测线粒体呼吸和糖酵解的实时动态变化，区分代谢表型（如氧化型 vs 糖酵解型）。
d特定代谢途径分析
脂肪酸氧化代谢：使用长链脂肪酸氧化压力测试试剂盒。
谷氨酰胺代谢：选择谷氨酰胺氧化压力测试试剂盒。
    除了进口试剂盒，也可以选择安理的国产试剂盒，优势也是比较明显的，包括如下方面：即开即用、无需稀释、按次配比、货期短、价格实惠。
Q4. 动物细胞有两条关键的能量代谢通路，是哪两条？
    有氧呼吸和糖酵解。
Q5. 细胞能量代谢可检测的样本有哪些？
    包括贴壁细胞、悬浮细胞、细胞球、组织、分离的线粒体、模式生物。
Q6.  Seahorse细胞能量代谢仪器在使用前需要提前多久开机预热？
    需要5小时以上。
Q7.做细胞能量代谢实验需要准备哪些试剂耗材？
     细胞板、探针板、水化液、试剂盒、培养基、底物。
Q8.Seahorse归一化方法有哪些？
     方法包括：细胞计数、总蛋白浓度、核DNA。目前，细胞能量代谢实验比较理想的归一化方法是原位全孔细胞成像计数。比如安理科技的Falcon S300全自动归一化分析系统，就是基于此种技术进行归一化的，其特点包括：无需消化原位计数、操作简单、计数准确、省时省力。

 

[实验细节部分]

 

Q1.Seahorse相关试剂存储条件是怎么的呢？
    基础培养基类，请4℃避光保存，避免冻结。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃；板子及常见的试剂盒，室温存储即可。
Q2.Seahorse XF 相关试剂盒的说明书在哪呢，有中文的吗？
     公司一直提倡遵循环保理念，当您收到试剂盒后，标签面都有一个二维码，扫描即可下载说明书。部分有中文说明书，请联系相关技术支持索取。

Q3.  Seahorse 24/96 孔微孔板的尺寸是多少？

 

Q4.XFp/XFe96细胞培养微孔板的每个细胞孔的最大体积及底面积是多少？
    275 µL；底面积是正常96孔板底面积的40%。
Q5.XFe24细胞培养微孔板的每个细胞孔的最大体积及底面积是多少？
     1000 µL；底面积和正常96孔板底面积一样大小。
Q6. 对于某种细胞，有没有推荐的细胞接种数？
     官方给出的贴壁细胞接种数范围是，XFe96/XFp: 5000-40000/孔; XFe24: 10000-80000/孔; HS Mini:约XFp细胞量的1/3每孔。
     悬浮细胞的接种数一般要比贴壁细胞高一个数量级。
不同物种、组织来源的细胞大小、形态各异，生长速度也存在差异，所以不同种细胞在Seahorse细胞板的接种数是不一样的。官方提供有18种细胞推荐的细胞数，但考虑到各实验室细胞状态、培养条件、操作手法的差异性，即使是相同名称的细胞，也不能完全照搬官方或别人文章里的细胞接种数。
Q7. Seahorse 实验时，我担心细胞量少，我多种点细胞可以吗？
     细胞的密度需要摸索，在实验上机前，长满板底面积80-90%为最佳，设置一个密度梯度，找到最佳的密度；细胞过密会使检测时形成的瞬间微室氧气快速耗尽。
Q8. Seahorse 实验，接种细胞和平时种细胞有区别吗？
     细胞培养板种细胞时候，枪头抵壁，与水平面呈45°角度加入，加完在超净台静置1小时，有助于促进细胞均匀分布并减少边缘效应。96孔细胞板种80ul；24机型的板子分二步，先每孔接种100 μL细胞悬液，培养细胞1-6小时，细胞贴壁后，再补充生长培养基，每孔加入150μL生长培养液,总体积为250 μL。加液时沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。
Q9.Seahorse能测悬浮细胞吗？
     能测。不管是贴壁细胞，还是悬浮细胞，都可以测。Seahorse要求细胞在上机前是贴壁的。对于悬浮细胞来说，可以使用粘附剂，如多聚赖氨酸、cell-tak、明胶等预先包被Seahorse细胞板，再通过低速离心细胞板来使悬浮细胞贴壁。
Q10.使用组织黏附剂处理细胞培养板会影响XF实验测量吗？
     不会。使用诸如poly-L-Lysine，fibronectin，Gelatin，poly-D-lysine，Cell-Tak™等组织黏附剂处理细胞培养板时，不会影响XF仪器测量的效果及实验参数分析。
Q11.Seahorse的检测液（或者叫培养基）能不能用我们实验室自己的培养基？与我们自己的培养基有什么不同？
     Seahorse pH 7.4的检测液，目前有两种，一种基于DMEM，另一种基于RPMI 1640，都不含碳酸氢钠、酚红、血清、葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺。碳酸氢钠和酚红均会影响pH的测量，血清会干扰药物作用，因此在Seahorse检测时，这三种组分是不含的。此外，为了在检测代谢的时候让细胞有充足的底物供应，是在实验前一天或当天往检测液中现用现加葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺（糖酵解压力测试只需要加入谷氨酰胺）。
Q12.使用pH 7.4 的 DMEM 或 RPMI 基础培养基制备检测液时，加上Seahorse实验所需的三个底物，是否就无需调整pH了？
      如果你使用的是base检测液，也就是含酚红的粉红色培养基，那么必须调。调pH既可以用pH计，也可以用pH试纸。如果使用pH计，最好确保近段时间pH计被校准过；如果不确定什么时候做的校准，可以当下校准。
      如果你使用的是Seahorse pH 7.4的检测液，添加的是官方的葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺溶液，那么恭喜你，可以省略调pH的步骤了。ATP速率测定和糖酵解速率测定实验，由于测量的参数是PER（质子流出速率），对pH准确度的要求尤其高，半点马虎不得！
Q13.检测液的pH对Seahorse实验非常重要吗？
     是的，非常重要，最好使用商品化产品。
Q14.如果平时用来培养细胞的培养基既不是DMEM，也不是RPMI 1640，该选择哪一种Seahorse检测液？
      这个时候，可以选择DMEM pH 7.4检测液。组织和原代细胞的培养基往往与传代细胞的培养基不同，处理这类样品时，很多文章里面都是直接选用DMEM检测液。
Q15.Seahorse的检测液有好几种，在选择购买的时候有没有什么需要注意的地方？      Seahorse DMEM medium, pH 7.4与RPMI medium, pH 7.4适用于所有Seahorse实验，包括压力测试和速率测定。
Seahorse base medium不适用于ATP速率测定、糖酵解速率测定和Hu T细胞活化测定实验。因为速率测定对于pH测量的要求要高于压力测试，base检测液含有酚红，会轻微干扰pH的测量。
Q16.Seahorse XF检测液中需要加入抗生素吗？
      无需加入抗生素，因为大部分XF实验在几小时内就结束了。
Q17.可以在Seahorse检测液中加入血清吗？
      不建议加入血清（如：FBS），因为其会影响检测液的缓冲能力，并可能与进行检测的药物/化合物发生非特异性结合而影响检测效果，同时容易产生气泡。另外，使用加入血清的检测液溶解药物加载至探针板加药孔中进行注射时，会出现漏药或加药注射失败。
Q18.加入底物的检测液在多长时间内可保持稳定？或可以提前配好检测液和药物吗？
      Seahorse检测液在实验当天现用现配。药物也要现配现用，溶解后的药物要一次性用完，剩余的也不能用于下次实验了。
Q19. 为何不能使用GlutaMAX来代替Glutamine呢？
      不建议使用GlutaMAX来配制检测液。因加入GlutaMAX后，还需细胞进一步将其转化为glutamine，这可能会影响线粒体对Glutamine氧化的动力学过程。
Q20.FluxPak中的水化板可以替代细胞培养板吗？
     不可以，虽然水化板与细胞培养板结构相同，但不能用来培养细胞。
Q21.可以使用超出保质期的探针板或重复使用探针板吗？
     无法保证因使用超出保质期的探针板或重复使用探针板而得到的实验数据质量(有效性)，为得到最佳的、最真实的数据，请使用有效期内的探针板及其它消耗品。
Q22.探针板水化的相关时间有什么要求？
      建议将探针板放入37℃无CO2培养箱中水化过夜以得到最优结果。最短水化时间是37℃水化12小时。探针板最长水化时间是37℃水化72小时，不能超过此时限。有专门的仪器可以辅助水化操作，比如安理科技公司推出的水化平衡系统Kangaroo4，该设备可一次性处理4块水化探针板，而且体积小巧，可放置到超净工作台内使用。除了用于Seahorse探针板水化平衡外，还有如下使用场景，Seahorse检测板换液后脱气，其他需控温预热或孵育的场景。
Q23.一次实验可以只使用探针板其中的一部分吗？
     为了将所有药物或化合物成功地注入细胞培养孔中，建议水化整个探针板并因需要将相同字母标注的全部加药孔注入药物（请参考实验流程中关于加载药物的注意事项）。背景孔的加药孔也必须加上药物，保证所有的A加药孔体积一致，B、C、D孔同理，否则会造成打药失败；
Q24.计划明天做实验，我今天要做些啥？
      实验前一天，打开主机，打开电脑，同时点开Wave软件，确保是Connected的状态，水化探针板，贴壁细胞提前接种到Seahorse的细胞培养板里。
Q25.实验中为何必须设置背景校正孔？
     背景校正孔被用来过滤掉实验的干扰因素，比如温度和 buffering capacity，这些干扰因素会影响氧含量和pH变化（非来源于代谢变化的影响）。背景校正孔还能被用来修正整板间温度波动，来诊断潜在温度问题，以及作为实验获得非期望数据时原因筛查的切入点。
Q26.背景校正孔怎么设置？
      背景校正孔里除了没有细胞，其它所有操作和细胞孔一致。96机型背景校正孔（A1,A12, H1, H12，即4个角）不接种细胞；24机型背景校正孔设置为（A1, B4, C3, D6）；确保背景校正孔中只加入培养液（无细胞）
Q27.为何细胞培养板需要在 37℃无CO2 培养箱中放置45-60min？
      细胞培养板在37℃无CO2培养箱中孵育45-60min的目的是为了脱气，释放CO2。
Q28.上机前如何判断细胞状态，确保实验成功呢？
     上机前一般要在显微镜下观察下细胞状态和汇合度情况，但是这种汇合度的判断往往不客观，也不能获取整个孔的信息。此时可利用脱气时间，用Falcon S300检测上机前整板全孔细胞状态，客观判断细胞汇合度，减少实验失败概率。汇合度的判断主观因素比较强，这就带来了很多误差。而Falcon S300能够给出客观判断的细胞汇合度，当汇合度达到70%-90%即可上机检测。在实验的过程中，有一种情况时有发生，对于贴壁不牢的细胞或者换液操作不当，会导致板底细胞缺失，其实这也是之前有时候seahorse孔间重复性相对较差的一个很主要的原因。针对这种情况，如果缺失的孔比较多，我们可以选择不上机，减少实验成本和时间的浪费。如果是个别孔，我们可以做好记录，做到心中有数，也就是整个实验过程的可视化，随时可以回溯查找原因。
Q29.第一次做Seahorse实验，需要优化哪些条件？  
     主要是细胞接种密度和FCCP的药物浓度。
Q30. Seahorse探针板上机前加药，需要注意什么？ 
      加药时同样方法，枪头抵着加药孔壁大约与水平面呈45°度角，将液体一次性加入到加药孔中，注意板子始终保持在平面上，加完药的探针板不能晃动，以免加入的液体漏入水化板中。（24的机型，在加药前需要取下粉色的水化辅助板）；
Q31. 线粒体压力测试，针对某种细胞，有没有推荐的FCCP浓度？ 
      没有，不同细胞对于FCCP的敏感性不同，一个FCCP的浓度不能包打天下。FCCP是线粒体解偶联剂，能够激活最大呼吸。所谓最佳FCCP浓度，是找到一个FCCP浓度，使得无论是高于还是低于这个浓度，都没有这个浓度的FCCP激活耗氧率 (OCR)高。换句话说，就是找到一个FCCP的浓度拐点。如果你设的几个FCCP浓度，OCR随着FCCP浓度的增加也一直在增加，说明拐点在更高的浓度。
FCCP浓度不是越高越好。各位，你们可不能想当然认为如果1 μM FCCP没有使OCR明显升高，下次做就把FCCP浓度升到2 μM哦！对于某些细胞来说，可能低浓度的FCCP就能激活最大呼吸了，过犹不及。
      最靠谱的方式是按照说明书，老老实实稀释几个不同浓度的FCCP，做浓度滴定实验。对于XFe96来说，可以实现在一块板子上同时完成细胞数与FCCP浓度梯度的滴定实验；对于XFe24来说，在确定细胞数的基础上，一块板子基本也能完成FCCP浓度的滴定实验。当然，如果一块板不行，那就两块。预实验看似多了一步，但总比实验结果不好再返工要强哦。
     文献里面的FCCP浓度不一定靠谱。因为不同实验室即使用的是同一种细胞，接种的细胞数和FCCP浓度往往会不同。参考文献的时候，要货比三家，就像我们在购物时那样。
Q32.除了线粒体压力测试，其它的试剂盒需不需要摸索药物浓度？ 
     如果你用的材料是细胞，一般不需要。官方推荐的药物浓度，如1.5 μM oligomycin（寡霉素）、0.5 μM rotenone/antimycinA（鱼藤酮/抗霉素A）适用于大多数细胞。当然，如果发现某种药效果不明显，可以尝试做浓度梯度来确定合适的浓度，厂家试剂盒里面的药足够做浓度滴定。
      如果你用的材料是组织，比如组织块、组织切片，药物浓度一般要高于细胞，最好能够通过设置梯度来确定合适的浓度。
Q33.Seahorse 细胞板上机时候，放进去应该就可以了？
      探针板和细胞板放入仪器时，朝向为A1孔朝向机器内部，记得把盖子拿掉。
 

[数据处理部分]

 

Q1.Seahorse XF 实验后，是否需要做归一化处理呢，有哪些方法呢？
     功能生物数据的归一化是原始数据展示和后续分析工作流程中的关键因素，以确保对结果的准确一致的解析。XF 代谢分析在这方面也是如此，大多数实验需要进行某种形式的归一化。无论是比较不同的细胞类型、基因修饰还是化合物处理，都必须根据共同的参数将数据归一化以便正确比较。
常用的方法，蛋白定量，细胞成像计数，核DNA的检测等。目前，细胞能量代谢实验比较理想的归一化方法是原位全孔细胞成像计数。比如安理科技的Falcon S300全自动归一化分析系统，就是基于此种技术进行归一化的，其特点包括：无需消化原位计数、操作简单、计数准确、省时省力。
Q2. Seahorse数据分析软件Wave可以免费下载安装吗？
     是的，可在安捷伦官网找到Wave软件下载网址，并且免费下载安装。
Q3. Seahorse XF报告生成器中的代谢数据是如何计算的？
     在每个试剂盒的Seahorse XF报告生成器的用户指南中详细列出了数据的计算公式，请参阅。
Q4.  Seahorse XF 仪器模板选项中没有想检测试剂盒的模板怎么办？
     可在桌面板wave软件中将相应实验模板先导出到 U 盘中，再导入XF 仪器模板库即可。
Q5.  Seahorse数据分析软件导出选项中没有对应的report generator？
     当软件导出选项中无相应的report generator时，请移步到Agilent官网细胞分析软件下，下载最新wave分析软件，也可以在对应试剂盒的菜单中下载对应的report generator。(https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software#0 )
Q6.Seahorse Wave 分析软件，我的电脑怎么都安装不上，怎么办？
    当软件无法安装时，可采用 Seahorse Analytics云分析， 这是一款网页形式的 Seahorse XF 数据分析软件，用户可以通过任何一台电脑安全地存储、访问和分析数据。极大地简化了用户的数据分析流程(https://www.agilent.com/zh-cn/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485)

 

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2025年4月2日 14:19
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