安理汇||文献分享 米屈肼作为一种潜在的神经保护剂通过在脑缺血-再灌注损伤中保护线粒体来促进神经元存活
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安理汇||文献分享 米屈肼作为一种潜在的神经保护剂通过在脑缺血-再灌注损伤中保护线粒体来促进神经元存活
【文献摘要】2024年8月，北京药理毒理学研究所毒理学与医学对策国家重点实验室（军科院）等单位的相关研究人员在《Journal of Translational Medicine》（IF: 6.1）上发表了题为Meldonium, as a potential neuroprotective agent, promotes neuronal survival by protecting mitochondria in cerebral ischemia–reperfusion injury”的研究论文，报导了米屈肼作为一种潜在的神经保护剂，通过在脑缺血-再灌注损伤中保护线粒体来促进神经元存活。
●米屈肼显著减少了梗死面积，改善了神经功能和运动能力，并抑制了体内的神经元凋亡。
●在大鼠的脑缺血-再灌注损伤中，米屈肼增强了线粒体的形态、抗氧化能力和ATP生成，并抑制了线粒体通透性转换孔（mPTP）的开启。此外，米屈肼改善了神经元线粒体的融合过程和呼吸功能。
●米屈肼通过激活Akt/GSK-3β信号通路，抑制了依赖线粒体的神经元凋亡。
在本研究中，运用Seahorse技术，检测细胞外氧气消耗速率（OCR）和质子酸化速率（PER），评估线粒体的呼吸功能和ATP生成能力，从而帮助研究人员验证米屈肼在氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）损伤条件下对神经元线粒体功能的保护作用。
Seahorse技术作为一种群体学功能数据检测手段，检测结果与每孔细胞数目直接相关，而实验过程中很多因素都会影响细胞数目，因此原始数据归一化非常重要。在本研究中，研究人员利用安理科技的全自动归一化分析系统（Falcon S300）以及配套归一化荧光检测试剂盒（DAPI,ALN23011）对Seahorse下机后的96孔检测板直接进行原位全孔细胞成像和计数分析，一键式导入Wave软件，实现Seahorse原始数据的归一化处理，使不同处理组之间的细胞数量差异得到校正，获得更客观准确的Seahorse实验结果。
Falcon S300在Seahorse细胞代谢实验中的应用：
●1）摸索细胞接种密度，降低Seahorse实验成本。
●2）确定最佳上机时间，70%-90%最为适宜。
●3）换液后，利用脱气时间，检测全孔细胞形态和汇合度，确定是否继续进行上机实验。
●4）细胞均一化：Seahorse下机后，直接进行全孔原位细胞成像和计数分析，一键式实现数据归一化。
中风是一种全球性的危害，能够引起不可逆的神经元损伤，且治疗手段有限。米屈肼是一种抑制肉碱依赖代谢的药物，被认为具有抗缺血作用。然而，米屈肼改善缺血性损伤及其潜在的神经保护机制仍不完全明确。
近年来，由于不规律的日常作息和过度饮食，中风的发病率在年轻人群中逐渐上升。中风是全球第二大死亡原因，约占全球死亡人数的11%。缺血性中风在中国和美国的病例分别占74%和85%。血栓形成会导致脑动脉的血流减少或停止，引发缺血性中风，进而导致神经元迅速死亡。虽然组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是美国食品和药物管理局（FDA）批准的唯一治疗急性缺血性中风的药物，但其应用受到时间窗限制，仅适用于少数中风患者。
线粒体功能障碍是缺血性中风后神经元死亡的重要标志。因此，维持脑缺血-再灌注损伤中的线粒体功能是潜在的治疗策略。米屈肼一直被认为是肉碱生物合成的抑制剂，其主要作用机制是调节细胞能量代谢。许多研究表明，米屈肼在治疗心脏和肾脏的急性缺血-再灌注损伤方面具有显著效果。然而，尽管米屈肼在治疗多种神经系统疾病上显示出潜力，但其在脑缺血-再灌注损伤中的具体机制尚不明确。
本研究旨在探讨米屈肼 对神经元存活、梗死面积、病理损伤和神经元凋亡的保护作用。结果表明，米屈肼能有效减轻大脑的氧化应激，保护线粒体结构和功能，从而防止神经元凋亡。
1. 米屈肼改善了大鼠 MCAO（中大脑动脉阻塞）模型的运动功能并减轻了皮层和海马区的凋亡
研究团队采用大鼠 MCAO 模型来研究米屈肼对脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的保护作用。通过 Zea-Longa 评分标准评估大鼠的神经功能缺陷。结果显示，与假手术组相比，MCAO 大鼠的神经功能缺陷评分显著增加。然而，100 mg/kg 和 200 mg/kg 的米屈肼以及对照药物 Edaravone 处理组的大鼠，神经功能缺陷评分显著降低。TTC（2,3,5-三苯基四氮唑氯化物）染色显示，MCAO 大鼠的大脑梗死体积显著增加，而米屈肼和 Edaravone 治疗组的大鼠梗死体积显著减少。
旋转杆测试用于评估大鼠的运动功能。MCAO 大鼠在 3 天、7 天和 14 天后表现出显著的运动能力下降。然而，经过米屈肼和 Edaravone 处理后，14 天后大鼠的旋转杆滞留时间显著增加，表明米屈肼可以改善 MCAO 大鼠的运动功能。
此外，研究团队观察到 MCAO 大鼠的皮层和海马区神经元排列松散，伴随核溶解和核浓缩的病理变化。米屈肼和Edaravone 处理组显著减少了这些病理变化。TUNEL 染色显示，MCAO 大鼠的皮层和海马区凋亡神经元显著增多，而 米屈肼（50, 100 和 200 mg/kg）显著减少了皮层和海马区的神经元凋亡。
为了进一步理解米屈肼对线粒体的保护作用，研究团队使用透射电子显微镜（TEM）观察大鼠皮层和海马区的神经元线粒体超微结构。结果显示，与假手术组相比，MCAO 大鼠的皮层和海马区神经元线粒体显著损伤，表现为线粒体肿胀、嵴密度减少、膜破裂。经过米屈肼处理后，线粒体的形态得到了明显改善。
研究团队还检测了线粒体通透性转换孔（mPTP）的开启和 ATP 生成。与假手术组相比，MCAO 大鼠的皮层和海马区 mPTP 开启显著增加，而 200 mg/kg 的米屈肼和 Edaravone 能有效抑制 mPTP 的过度开启。此外，MCAO 大鼠的皮层和海马区 ATP 含量显著下降，而 200 mg/kg 的米屈肼能显著改善 ATP 含量，Edaravone 在这一方面未表现出显著的保护作用。
3. 米屈肼提高了MCAO 大鼠线粒体的抗氧化能力
研究团队还评估了大鼠皮层和海马区线粒体的抗氧化能力。结果显示，MCAO 大鼠皮层和海马区的 SOD（超氧化物歧化酶）活性、T-AOC（总抗氧化能力）和 GSH（谷胱甘肽）含量显著下降，而 MDA（丙二醛）水平显著升高，表明 MCAO 诱发了氧化应激反应。米屈肼和 Edaravone 处理后，SOD 活性、T-AOC 活性和 GSH 含量显著增加，同时 MDA 含量显著减少，说明米屈肼通过减少氧化应激提高了抗氧化能力。
4. 米屈肼 在 OGD/R（缺氧-葡萄糖剥夺/再灌注）损伤中维持了神经元线粒体的功能
为了进一步探讨米屈肼对神经元线粒体的作用，研究团队使用大鼠初级海马神经元建立了 OGD/R 模型。MTT 实验结果表明，米屈肼（10 μM, 50 μM 和 100 μM）显著提高了 OGD/R 条件下的神经元存活率。此外，JC-1 染色显示 OGD/R 组的线粒体膜电位（Δψm）显著丧失，而米屈肼（50 μM 和 100 μM）显著维持了 Δψm。
研究团队还使用 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试和实时 ATP 生成率测试评估了线粒体呼吸功能和 ATP 生成。结果显示，OGD/R 组的基础呼吸、最大呼吸、ATP 生成和非线粒体耗氧量显著减少，而 米屈肼 能有效保护这些线粒体功能。此外，米屈肼显著减少了 OGD/R 诱导的 ROS 生成。
5. 米屈肼抑制了 OGD/R 诱导的线粒体过度分裂
线粒体是高度动态的细胞器，分裂和融合的不平衡会导致线粒体形态和功能的丧失，最终导致细胞死亡。OGD/R 诱导了线粒体分裂蛋白 Drp1 的过度表达以及线粒体融合蛋白 MFN1、MFN2 和 OPA1 的显著减少。米屈肼 显著增加了线粒体融合蛋白的表达，并改善了 OGD/R 条件下神经元线粒体的形态。
6. 米屈肼通过 Akt/GSK-3β 信号通路抑制线粒体依赖性凋亡
通过生物信息学分析，PI3K-Akt 信号通路与中风密切相关。研究团队发现，OGD/R 组神经元 Akt 和 GSK-3β 的磷酸化水平显著下降，而 CyPD、细胞色素 c 和活化的 caspase-3 水平显著上升。米屈肼 处理显著增加了 Akt 和 GSK-3β 的磷酸化水平，并抑制了 Cyt c 释放和 caspase-3 的激活，表明 米屈肼 通过 Akt/GSK-3β 信号通路抑制了线粒体依赖性凋亡。
心脑血管疾病仍是全球主要的致死原因，其中缺血性中风是一种由动脉闭塞引发的多重生化事件，包括神经元兴奋性毒性、氧化应激、炎症和凋亡。这些事件导致细胞死亡和大脑梗死，并可能引发各种神经功能缺陷，如瘫痪、言语障碍、认知功能受损等。目前，临床治疗中风的方法包括溶栓治疗、治疗与中风相关的并发症以及预防复发。然而，这些治疗在促进神经元再生和恢复大脑功能方面作用有限。米屈肼通过改善线粒体功能、减少氧化应激和抑制神经元凋亡，表现出神经保护作用。
本研究发现，米屈肼通过保持线粒体动力学平衡和呼吸功能，能够减少脑缺血-再灌注损伤中的神经元凋亡，并显著改善动物的运动功能。米屈肼 通过激Akt/GSK-3β信号通路，抑制了线粒体通透性转换孔的过度开放，从而阻止了细胞色素c的释放，抑制了caspase3介导的神经元凋亡。
米屈肼具有潜在的治疗中枢神经系统疾病的作用，但本研究也有一些局限性。例如，除了在急性损伤期间提高神经元存活外，还需进一步研究其是否能够促进神经轴突的生长、树突的重塑以及新的神经网络的形成。这些研究为米屈肼在神经系统疾病中的应用提供了重要的基础数据。
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