细胞能量代谢数据归一化的必要性及方法介绍
为什么要对细胞能量代谢数据进行归一化处理？
功能生物数据的归一化是原始数据展示和后续分析工作流程中的关键因素。细胞能量代谢分析技术作为一种群体学功能数据检测手段，检测结果与每孔细胞数直接相关，而实验过程中很多因素都会影响细胞的数目，包括过夜培养带来的细胞数目差异、不同干预处理导致的细胞生长速率变化，以及更换检测液人为冲掉细胞等因素，因此无论是比较不同的细胞类型、基因修饰还是化合物处理等对细胞能量代谢的影响，都必须根据共同的参数将数据归一化之后，才能确保对结果准确一致的解析。
细胞能量代谢数据归一化都有哪些方法？
传统采用的归一化方法有细胞总蛋白定量、核DNA定量、消化后细胞计数，此类方法的优势是基于实验室已有条件容易实现，但都存在操作繁琐，样本传输带来的误差导致结果不准确的问题；目前，科研领域推荐采用10倍物镜下全孔原位细胞成像计数的方法来进行细胞能量代谢数据的归一化处理，该方法无需对细胞进行裂解或消化，全孔原位成像，自动分析计数，减少人工操作或局部计数带来的误差，是目前适用性最为广泛的准确客观便捷的归一化方法。
归一化方法介绍
01 细胞总蛋白定量
在细胞样本前处理过程不会改变细胞总蛋白含量的情况下，可根据细胞总蛋白质含量对细胞能量代谢数据进行归一化。利用该方法进行归一化需配置酶标仪及相应检测试剂盒。操作流程相对耗时，细胞裂解后，将孔内样品通过Bradford或BCA蛋白检测试剂进行定量分析。如果细胞处理导致线粒体生物合成发生变化，改变了细胞的蛋白质含量，或不同实验组之间的细胞外基质蛋白质含量存在显著差异，或如果培养板基底包被了含有蛋白质的细胞粘附剂（如胶原蛋白、层粘连蛋白、Matrigel®），则细胞总蛋白质归一化处理方法不适用[1]。
02 核DNA定量
03 消化后细胞计数
04 全孔原位细胞成像和计数——理想的细胞能量代谢归一化方法
Falcon S300全自动归一化分析系统
图1显示了使用Falcon S300，10倍物镜下，进行全孔原位核染色成像和计数，然后用于细胞能量代谢表型测试数据归一化的示例。
10X物镜，高清晰度识别细胞
蓝色荧光通道：ex/em：380/460 Eg: Hoechst, DAPI
绿色荧光通道：ex/em：480/530 Eg: FITC，GFP,AO，Calcein
原位染色
核计数
图2.使用全孔原位成像和细胞计数的细胞能量代谢数据归一化的示例。细胞以1 × 104、2 × 104、3 × 104 细胞/孔进行点样，培养24小时，进行细胞能量代谢表型测试，然后进行图像分析。A) 原始 OCR 和 ECAR 随寡霉素 + FCCP 加药+ ROT/AA 加药（分别为 1.0 µmol/L、0.5 µmol/L、0.5 µmol/L 终浓度）而发生变化，包括 20 µmol/L DAPI（2 µmol/L 终浓度）。B) 由 DAPI荧光标记的细胞核（上图）以及使用 Falcon S300成像和计数的细胞核的代表性图像。C) OCR 和 ECAR 通过全孔原位成像细胞计数进行归一化（平均值 ± SD，n = 4）
归一化方法比较
细胞总蛋白定量、核DNA定量、细胞计数、全孔原位细胞成像计数等归一化的方法，各自具有各自的优缺点，用户可根据样本类型以及实验条件选择适合的归一化方法。表1列出了上述归一化方法的主要优点和缺点：
表1：方法比对
| 归一化方法 | 相关配套 | 优点 | 缺点 |
| 细胞总蛋白定量 | 酶标仪、蛋白定量试剂盒 | 1）实验条件容易具备，大部分实验室配备有酶标仪 |
1） 多次移液操作带来误差，影响结果准确性 2）不兼容ECM包被板（悬浮细胞或贴壁不牢的细胞需包被板进行检测） 3）不适用于线粒体生物合成发生变化的检测实验 4）破坏细胞获得蛋白质，无法进行下游细胞学实验 5）流程繁琐，耗时长 |
| 核DNA定量 | 多功能酶标仪、荧光染料试剂盒 | 1）实验条件容易具备，大部分实验室配备有酶标仪 |
1）多次移液操作带来误差，影响结果准确性 2）不适用于多核细胞 3）流程繁琐，耗时长 |
| 消化后细胞计数 | 全自动细胞计数仪 | 1）实验条件容易具备，大部分实验室配备有细胞计数仪 |
1）多次移液操作带来误差，影响结果准确性 2）试剂耗材成本高 3）流程繁琐，耗时长 |
| 全孔原位细胞成像和计数 | 全自动归一化分析系统、荧光染料 |
1）10倍物镜全孔原位成像，有图有真相，结果更准确2）下机后直接染色计数，操作简便。 3）最快20min内获得整板细胞计数结果 |
1）需配备专用的全孔原位细胞成像分析设备 |
参考文献
1. Liu,T.F.,et al., Sequential actions of SIRT1-RELB-SIRT3 coordinate nuclear-mitochondrial communication during immunometabolic adaptation to acute inflammation and sepsis. J Biol Chem, 2015. 290(1): p. 396-408
2. Lorenz, C., et al., Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell, 2017. 20(5): p. 659-674. e9
3. Ya Yan1,2, Lei Wu1,2，et al. Species-specific cleavage of cGAS bypicornavirus protease 3C disruptsmitochondria DNA-mediated immune sensing. PLoS Pathog19(9): e1011641
4. Xiaodi Hu1,9, Mingwei Sun2,9, Qian Chen1, et al. Skeletal muscle-secreted DLPC orchestratessystemic energy homeostasis by enhancingadipose browning. Nature Communications | (2023) 14:7916
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